Phương pháp nghiên cứu di truyền học phân tử

Để khám phá và xác định các biến thể trong cấu trúc DNA sử dụng phương pháp di truyền phân tử. Đối với mỗi khu vực DNA, khám phá khu vực này của nhiễm sắc thể, gen hoặc alen, các phương pháp khác nhau. Cơ bản mỗi phương pháp di truyền phân tử gồm một số hoặc thao tác khác của RNA và DNA. Tất cả các phương pháp này được đặc trưng bởi một sự phức tạp rất lớn, mà không cần điều kiện phòng thí nghiệm không thể được thực hiện, và các nhân viên phải có trình độ cao. Công việc này được thực hiện theo nhiều giai đoạn.

giai đoạn

Thứ nhất, RNA hoặc DNA mẫu được sản xuất. Ở đây, một phương pháp di truyền phân tử có thể được áp dụng cho hầu như bất kỳ vật liệu: một giọt máu, bạch cầu, các nguyên bào sợi văn hóa, niêm mạc (cạo), thậm chí các nang tóc, - DNA có thể được lấy từ bất kỳ mẫu. Nó phù hợp để sử dụng bất kỳ phương pháp di truyền phân tử và các tùy chọn khác nhau của họ và đã DNA dài cô lập được lưu trữ đông lạnh. Giai đoạn thứ hai là dành riêng cho sự tích tụ của các mảnh vỡ mong muốn (khuếch đại) của DNA, vì nó giúp đảm bảo polymerase chain reaction in vitro (in vitro mà không cần sự tham gia của sinh vật sống). Kết quả là, các nhân lên đoạn ADN chọn bởi phản ứng dây chuyền này, và số lượng ADN tăng nghĩa là hàng triệu lần.

Bước thứ ba trong các phương pháp nghiên cứu di truyền phân tử được giả định hạn chế nhân lên DNA (phân mảnh này, xé hoặc cắt). Hạn chế thực hiện bằng điện di trên polyacrylamide hoặc gel agarose. Phương pháp này di truyền phân tử nghiên cứu các đoạn DNA cho phép tất cả mọi người để có một vị trí nhất định trong gel. Sau đó, gel được xử lý bằng ethidium bromide, có khả năng gắn vào DNA, chiếu xạ với ánh sáng cực tím, sau đó người ta có thể quan sát phần phát quang. phương pháp chẩn đoán di truyền phân tử rất đa dạng và rất nhiều, nhưng hai bước đầu tiên là chung cho tất cả. Nhưng để xác định các mảnh ADN, gel có thể được tô màu, và nhiều phương pháp khác hiện có.

loài

Các phương pháp trực tiếp và rộng rãi nhất cho việc phát hiện mycobacteria có thể bao gồm các phương pháp học tập ADN di truyền phân tử ở trên. bản chất của nó là, để xác định vật liệu chuỗi quét của mảnh cụ thể của DNA của các mầm bệnh. các kỹ thuật chẩn đoán di truyền phân tử vẫn chưa có một cách hiệu quả hơn để nhận ra các bệnh như lao phổi. Sử dụng polymerase chain reaction (PCR), bạn có thể chắc chắn rằng DNA ban đầu sẽ làm tăng số lượng bản sao trong một triệu lần, có nghĩa là, sẽ có sự khuếch đại, và nó sẽ hiển thị kết quả. Mức độ nhạy cảm rất cao - hơn chín mươi lăm phần trăm, đó là lợi thế chính của phương pháp này.

Phần còn lại của các phương pháp di truyền phân tử nghiên cứu về tính hiệu quả của năng suất nhiều bản sao theo nghĩa đen đã tăng gấp đôi, vì trong trường hợp này các mẫu soạn thảo cho thấy một chuỗi oligonucleotide cụ thể tăng lên đến một trăm linh sáu lần. Ngay cả việc chẩn đoán văn hóa lao của hệ thống hô hấp làm giảm đáng kể độ nhạy của nó. Đây là lý do y học hiện đại dựa trên phương pháp di truyền phân tử của chẩn đoán bệnh lao. Một phương pháp được mô tả là có hiệu quả đặc biệt khi giao dịch với các mầm bệnh của biến đổi kháng nguyên cao, xác định rằng cách khác là nhiều khó khăn hơn - đòi hỏi đặc biệt phương tiện truyền thông dinh dưỡng và nuôi dưỡng thời gian dài. phương pháp di truyền sinh hóa và phân tử tạo ra hiệu ứng rất khác nhau về kết quả.

chẩn đoán bệnh lao

chẩn đoán Marshall PCR của bệnh lao phổ biến nhất là sử dụng những trình tự DNA được cụ thể cho tất cả bốn loại bệnh. Để đạt được mục tiêu này thường sử dụng cặp mồi phát hiện chuỗi LÀ yếu tố (IS-986, IS-6110), vì đây là những yếu tố đặc trưng cho loài di cư cao Mycobacterium tuberculosis và luôn luôn nhiều bản sao có mặt trong bộ gen. Ngoài ra chiết xuất DNA có thể được thực hiện từ những nền văn hóa thuần túy và lâm sàng (đờm của bệnh nhân) bằng bất kỳ phương pháp thích hợp khác. Ví dụ, có phương pháp Boom nơi đệm ly giải được sử dụng dựa trên thiocyanate guanidin và silica như DNA tàu sân bay. Số lượng bệnh nhân khác vi khuẩn nghèo tăng lên hàng năm, và do đó trong thực hành lâm sàng đã thiết lập một mức độ hoàn toàn khác nhau của tổ chức: Phương pháp di truyền phân tử nghiên cứu DNA đã được chơi một vai trò quan trọng trong chẩn đoán.

Tuy nhiên, chúng ta phải thừa nhận rằng nó không phải là không có nhược điểm. Phương pháp PCR là việc sử dụng thường mang lại một số lượng lớn các kết quả dương tính giả, và lý do là không chỉ lỗi kỹ thuật, mà còn các tính năng của phương pháp riêng của mình. Bên cạnh đó, sử dụng phương pháp này trong chẩn đoán để xác định tính khả thi của mycobacteria, mà đã được xác định, nó chỉ đơn giản là không thể. Nhưng nhược điểm này không phải là quan trọng nhất. phương pháp di truyền phân tử của chẩn đoán PCR kéo theo các nguy cơ ô nhiễm của DNA mycobacteria. yêu cầu cấp giấy chứng nhận vì lý do này mà cho các phòng thí nghiệm PCR được thiết kế dành riêng khó khăn, họ yêu cầu ba khuôn viên riêng. công nghệ PCR là hiện đại và rất phức tạp, nó đòi hỏi việc sử dụng các thiết bị phù hợp và cán bộ cao cấp được đào tạo.

bacterioscopy

Khi kết quả chẩn đoán của các phân tích phải được so sánh với dữ liệu khác: khám lâm sàng, chụp X quang, kính hiển vi bôi nhọ, cắt và thậm chí đáp ứng với điều trị cụ thể là rất quan trọng. Trong loạt bài này, các nghiên cứu PCR chỉ là một trong những thành phần. Phát hiện mầm bệnh trong chẩn đoán sớm có thể là phương pháp đơn giản nhất và nhanh nhất - vi khuẩn.

Có được sử dụng một kính hiển vi ánh sáng (màu Ziehl-Neelsen) và huỳnh quang (fluorochromes màu). Ưu điểm là tốc độ bôi nhọ các kết quả. Nhưng nhược điểm của nó là đúng coi là năng lực hạn chế do độ nhạy thấp. Tuy nhiên, phương pháp này được đưa ra khuyến cáo của WHO là kinh tế nhất và nền tảng để phát hiện bệnh nhân lao. Phát hiện mycobacteria phương pháp vi khuẩn có giá trị dự báo và ước tính số lượng bài tiết của vi khuẩn. Nhiều tự tin hơn để đối phó với nó phân tử phương pháp nghiên cứu di truyền của bệnh lao.

các nền văn hóa

phát hiện tốt hơn của mycobacteria nhận nghiên cứu văn hóa. Gieo liệu bệnh lý nó được lập thành phương tiện trứng: Mordovsky, Finn II, LJ, và những thứ tương tự. Điểm chuẩn của sức đề kháng của mycobacteria để thuốc và bằng chứng gián tiếp về hiệu quả của một số mycobacteria và thuộc địa của họ trong ống nghiệm, nếu áp dụng phương pháp của văn hóa nghiên cứu. Để tăng tỷ lệ phân lập mycobacteria cấy vật liệu bệnh lý được tổ chức trên nhiều môi trường.

Đáp ứng nhu cầu của đông đảo văn hóa, mầm bệnh trong đó có cấp và chất lỏng. Được sử dụng trong hệ thống này và tự động loại đo tăng trưởng VANTES. Cây trồng phải được tổ chức tại ủ cho đến bảy đến tám tuần. Đến thời điểm này cây trồng với sự thiếu tăng trưởng có thể được xem là âm tính. Cách hiệu quả nhất để phát hiện Mycobacterium tuberculosis xem xét các mẫu sinh học: lợn guinea liệu lây nhiễm chẩn đoán, đó là cực kỳ nhạy cảm với bệnh lao.

một số chỉ tiêu

lĩnh vực thú vị của nghiên cứu, được mở bởi chẩn đoán PCR là nghiên cứu M. tuberculosis - nhiễm trùng tiềm ẩn. Khái niệm hiện đại của nhiễm lao cho thấy rằng trong số một trăm người đã tiếp xúc với M. tuberculosis, chín mươi có thể cũng bị nhiễm, nhưng chỉ có mười trong số đó là bệnh của thành phố đang phát triển. Những người khác có khả năng miễn dịch TB, và vì chín mươi phần trăm các trường hợp nhiễm trùng vẫn còn tiềm ẩn. Phát hiện một mô hình nó đã giúp một phương pháp di truyền phân tử.

Nhà di truyền học nói rằng năm mươi lăm phần trăm của những người có bệnh lý cây trồng nguyên liệu là tiêu cực, tám mươi phần trăm người nhiễm M. tuberculosis, nhưng đượm không có biểu hiện X quang của bệnh, PCR phản ứng tích cực nhận. Nó là một phương pháp chẩn đoán di truyền giúp để xác định bệnh nhân có nguy cơ bằng cách nghiên cứu PCR, với kết quả phân tích của họ (soi và cấy) được tiêu cực, và nhiễm trùng cận lâm sàng M. tuberculosis đã có mặt.

nghiên cứu hiện đại

Liên bang Nga và các phòng thí nghiệm vi khuẩn học sử dụng một phương pháp gia tốc của nồng độ tuyệt đối: Hoạt động reductase nitrat của mycobacteria thử nghiệm bởi Griess thuốc thử. Trung tâm Chống TB sử dụng một phương pháp cho phép để xác định kháng thuốc. hạt giống này trong môi trường lỏng, nơi tự động phóng xạ và hệ thống kế toán huỳnh quang tăng trưởng của mycobacteria. một phân tích như vậy được thực hiện một cách nhanh chóng - lên đến hai tuần.

Hiện nay, phương pháp mới đang được phát triển: kháng thuốc của mycobacteria được đo ở cấp kiểu gen. Nghiên cứu các cơ chế phân tử của gen kháng và cho thấy sự hiện diện trong mycobacteria. Những gen có liên quan đến sự đề kháng với các loại thuốc nhất định. Ví dụ, gen Kasa, Inha, katG kháng với isoniazid, gen rpoB - gen RNA 16Sp rifampicin và rpsL - streptomycin, emb1 - để ethambutol, gyrA - một fluoroquinolone và vân vân.

đột biến

Việc chẩn đoán hiện đại tăng đáng kể các phương pháp cấp độ phân tử di truyền để nghiên cứu DNA và cho phép để thực hiện các nghiên cứu quy mô lớn của các đột biến trong tất cả các phổ của họ. Bây giờ chúng ta biết rằng những đột biến thường gặp nhất trong 516, 526 và 531 codon gen rpoB, và xác định được khả năng kháng thuốc khác nhau. Có một loạt các phương pháp để đánh máy của mycobacteria sử dụng không chỉ các phương pháp truyền thống - sinh hóa, sinh học và văn hóa, mà còn sử dụng rộng rãi các kỹ thuật di truyền phân tử hiện đại. Đã có đầy đủ và cung cấp các phương pháp chẩn đoán chính xác để phát hiện các bệnh monogenic. Chúng được dựa trên các nghiên cứu DNA trong khu vực chính xác của một gen cụ thể. Đây thường là một quá trình phức tạp, tốn nhiều thời gian và tốn kém, nhưng các dữ liệu được cung cấp bởi phân tích di truyền phân tử, là chính xác hơn nhiều và nhiều thông tin hơn so với dữ liệu của tất cả các phân tích khác.

Nó từ lâu đã biết rằng DNA không thay đổi cho toàn bộ đời sống của sinh vật mà nó đang ở trong bất kỳ tế bào odnakova có nhân, và điều này làm cho nó có thể để có những phân tích hoàn toàn tất cả các tế bào của cơ thể, tại bất kỳ giai đoạn nào của ontogeny. Gen bị hư hỏng có thể được phát hiện trước khi sự xuất hiện của các triệu chứng đầu tiên đến bệnh lâm sàng đầy đủ quy mô, cũng như ở những người dị hợp tử khỏe mạnh, nhưng có một đột biến ở gen. phương pháp chẩn đoán bệnh di truyền di truyền phân tử cho phép tiết lộ của nó (phương pháp trực tiếp, DNA-chẩn đoán), cũng như để phân tích sự phân biệt của bệnh trong gia đình với marker loci DNA (đa hình di truyền), được gắn kết chặt chẽ với một gen bị hư hỏng (ví dụ, cách tiếp cận gián tiếp của DNA chẩn đoán). Trực tiếp hoặc gián tiếp - bất kỳ chẩn đoán DNA được dựa trên các phương pháp xác định một phần đúng quy định của DNA của con người.

phương pháp trực tiếp

phương pháp trực tiếp chẩn đoán DNA là khi bệnh di truyền gen thủ phạm được biết đến, cũng như được biết đến, và các loại đột biến của nó. Ví dụ, một phương pháp trực tiếp phù hợp trong một số bệnh. Đây múa giật Huntington (mở rộng CTG-lặp đi lặp lại), phenylketonuria (R408W), xơ nang (delF508, đột biến lớn) và những thứ tương tự. Ưu điểm chính của phương pháp trực tiếp là một chẩn đoán chính xác hoàn toàn thuộc sở hữu, và không có cần phải làm một phân tích ADN của phần còn lại của gia đình. Nếu một đột biến ở gen tương ứng được tìm thấy, nó cho phép chính xác thông qua chẩn đoán di truyền, quyết tâm kiểu gen cho phần còn lại của gia đình gánh nặng.

Một ưu điểm khác của chẩn đoán trực tiếp được coi là để xác định một tàu sân bay dị hợp tử của đột biến xấu từ người thân và cha mẹ đã chết vì căn bệnh này. Điều này đặc biệt đúng đối với các bệnh tính trạng lặn. Nhược điểm của phương pháp trực tiếp cũng có sẵn. Để áp dụng chúng, bạn cần phải biết chính xác địa hoá gen bất thường, cấu trúc exon-intron của quang phổ của nó và đột biến của nó. Không phải tất cả các bệnh monogenic ngày nay đã nhận được thông tin đó. phương pháp trực tiếp Informativeness không thể được coi là hoàn thành, bởi vì một và cùng một loại gen có thể có một số lượng lớn các đột biến bệnh lý gây ra sự phát triển của bệnh di truyền.

phương pháp gián tiếp

Phương pháp gián tiếp trong chẩn đoán DNA được sử dụng ở tất cả, trong những trường hợp khác, nếu gen bị hư hỏng không được xác định, nhưng chỉ chromosomally, hoặc nếu chẩn đoán dòng không đưa ra kết quả (nó sẽ xảy ra, nếu gen phức tạp tổ chức phân tử hoặc một mức độ lớn, nếu có rất nhiều đột biến bệnh lý). Phương pháp gián tiếp thực hiện phân tích sự phân chia các mốc đa hình trong gia đình alen. Đánh dấu tìm thấy trong các khu vực nhiễm sắc thể giống nhau hoặc locus được gắn liền với căn bệnh này và đại diện xóa hoặc chèn, thay thế điểm, lặp đi lặp lại, và đa hình của họ là do số lượng khác nhau của các tế bào trong khối.

thuận tiện nhất để chẩn đoán coi microsatellite và minisatellite polymorphisms gián tiếp, được phân bố rộng rãi trong hệ gen của con người. giá trị của họ thể hiện trong nội dung thông tin cao, nếu thiệt hại cho khoảng cách di truyền giữa các marker và gen không phải là quá lớn. Trong trường hợp sau, tính chính xác ước lượng được xác định đến một mức độ lớn tần số tái tổ hợp giữa marker đa hình và thiệt hại. phương pháp chẩn đoán gián tiếp cũng cung cấp bước sơ bộ bắt buộc tần số alen của các nghiên cứu dân số phân tích giữa các bệnh nhân và những người mang đột biến, cộng với sự cần thiết phải xác định khả năng tái tổ hợp của thái không cân bằng và độ bám dính dấu và alen đột biến.

các phương pháp khác

phân đoạn ngắn của RNA hoặc DNA, cũng như gen duy nhất hình dung được nghiên cứu bằng kính hiển vi không thể, do đó, để xác định đột biến cần thiết cho chẩn đoán di truyền phân tử. Có một "Genome Project Human", cũng như những tiến bộ khác trong di truyền học phân tử mở rộng đáng kể khả năng chẩn đoán bệnh di truyền - cả trước và sau khi sinh. Những phương pháp này có thể cung cấp phát hiện sớm và thực hiện một poly- dự đoán và các bệnh monogenic, với những khán giả diễn ra ở tuổi trưởng thành. Thật không may, do khả năng kỹ thuật của các nghiên cứu di truyền phân tử đôi khi vượt quá giới hạn đạo đức được đặt trong mối quan hệ với thừa kế, đặc biệt là khi việc chẩn đoán là ở tuổi dậy thì và thời thơ ấu.

Kết cấu và số bất thường nhiễm sắc thể là những nguyên nhân phổ biến nhất của bệnh và ung thư, và nhiều dị tật. quang sai nhiễm sắc thể cần phải được xác định, đó là quan trọng đối với tư vấn gia đình - để đánh giá dự báo, cùng với nguy cơ sinh sản trong thai sau này. phân tích nhiễm sắc thể là "tiêu chuẩn vàng" trong chẩn đoán di truyền, nhưng nó bị hạn chế. Chỉ có phương pháp phân tích di truyền phân tử có thể làm nhiều hơn nữa, bởi vì có sử dụng nhân bản công nghệ dựa trên nhãn huỳnh quang có khả năng nhạy cảm cao của họ để xác định những thay đổi nhiễm sắc tinh tế mà không thể phát hiện cổ điển nghiên cứu di truyền tế bào. Những kỹ thuật này đang ngày càng mở rộng khả năng chẩn đoán của chúng tôi, khi kiểm tra, trẻ em khuyết tật phát triển, chậm phát triển tâm thần, với nhiều bệnh di truyền khác.

phát hiện

Điều rất quan trọng đối với nhân loại là những cấu trúc gen và chức năng của kiến thức, loại biến đổi, khả năng phát hiện bệnh di truyền xảy ra trong mối liên hệ với sự phát triển của di truyền học phân tử. phương thức của nó là nhằm mục đích nghiên cứu của phân tử ADN - và khi nó là bình thường, và khi nó bị hư hỏng. Chuẩn bị các chuỗi axit deoxyribonucleic nucleotide (DNA) kéo dài trong giai đoạn từ khi nhận được mẫu để xác định các mảnh cá nhân. Phân lập DNA từ các tế bào, hạn chế (rách), khuếch đại (nhân bản), điện di các mảnh vỡ (tách điện tích và khối lượng phân tử bằng gel agarose). Xác định các mảnh cụ thể nằm trên bề mặt của một sọc rời rạc.

Sau đó đi vào các bộ lọc đặc biệt hành động, qua đó vượt qua từng lai mảnh với những mảnh DNA nhân bản hoặc đầu dò phóng xạ nhân tạo là một điều khiển, mà sẽ bằng mỗi mẫu thử nghiệm. Nếu bạn thay đổi vị trí hoặc chiều dài so với thăm dò, nếu một đoạn mới hoặc biến mất - tất cả điều này cho thấy các gen phân tích đã trải qua tái cấu trúc trong chuỗi nucleotide. Có tám kỹ thuật cơ bản của nghiên cứu di truyền phân tử: trình tự (xác định trình tự DNA), Polymerase chain reaction (tăng về số lượng các chuỗi), việc chuẩn bị mồi biết gen, sao chép DNA, sản xuất của các phân tử tái tổ hợp có nguồn gốc protein do các phân tử tái tổ hợp, tạo ra một bộ hoàn chỉnh (bộ sưu tập thư viện) nhân bản mảnh vỡ đó đã thu được bằng cách sử dụng hạn chế.