Quang học huỳnh quang: nguyên tắc của phương pháp

Sự hấp thụ và sự reradiation khác của ánh sáng bởi các môi trường vô cơ và hữu cơ là kết quả của sự phát huỳnh quang hoặc sự huỳnh quang. Sự khác biệt giữa các hiện tượng bao gồm trong khoảng thời gian giữa sự hấp thụ ánh sáng và sự phát xạ của thông lượng. Dưới ánh huỳnh quang, các quá trình này diễn ra gần như đồng thời, và với sự phát quang, với một số chậm trễ.

Nền lịch sử

Năm 1852 nhà khoa học người Anh Stokes lần đầu tiên mô tả huỳnh quang. Ông đã giới thiệu một thuật ngữ mới như là kết quả của các thí nghiệm thực hiện với fluorspar, phát ra ánh sáng đỏ dưới ảnh hưởng của tia cực tím. Stokes ghi nhận một hiện tượng thú vị. Ông phát hiện ra rằng bước sóng với bức xạ huỳnh quang luôn luôn lớn hơn sóng thổi kích thích.

Để khẳng định giả thuyết trong thế kỷ 19, nhiều thí nghiệm đã được thực hiện. Họ cho thấy một loạt các mẫu huỳnh quang dưới tác động của tia cực tím. Trong số các vật liệu, trong số đó có các tinh thể, nhựa, khoáng chất, chất diệp lục, nguyên liệu dược liệu, các hợp chất vô cơ, vitamin, dầu. Áp dụng trực tiếp thuốc nhuộm cho phân tích sinh học chỉ bắt đầu vào năm 1930.

Quang học huỳnh quang: mô tả

Một số vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu nửa đầu thế kỷ 20 có độ đặc hiệu cao. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Do các chỉ số không thể đạt được bằng các phương pháp tương phản, phương pháp kính hiển vi huỳnh quang đã trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu y sinh học và sinh học. Kết quả thu được không có tầm quan trọng nhỏ đối với khoa học vật liệu.

? Lợi ích của kính hiển vi huỳnh quang là gì? Với sự trợ giúp của vật liệu mới, nó đã trở thành có thể cô lập các tế bào đặc biệt cao và các thành phần submicroscopic. Kính hiển vi huỳnh quang có thể phát hiện các phân tử riêng lẻ. Một loạt các thuốc nhuộm cho phép xác định một số yếu tố cùng một lúc. Mặc dù độ phân giải không gian hạn chế của thiết bị do giới hạn nhiễu xạ, do đó phụ thuộc vào đặc tính cụ thể của mẫu, nó cũng có thể phát hiện các phân tử dưới mức này. Các mẫu khác nhau sau khi chiếu xạ có sự tự huỳnh quang. Hiện tượng này được sử dụng rộng rãi trong ngành dầu khí, thực vật, ngành công nghiệp bán dẫn.

Các tính năng

Việc nghiên cứu các mô động vật hoặc vi sinh vật gây bệnh thường phức tạp do sự huỳnh quang tự nhiên quá yếu hoặc rất mạnh. Tuy nhiên, ý nghĩa trong các nghiên cứu này là sự đưa vào vật liệu của các thành phần kích thích ở một bước sóng nhất định và phát ra một luồng ánh sáng với cường độ yêu cầu. Fluorochromes hoạt động như thuốc nhuộm có khả năng gắn vào cấu trúc (vô hình hoặc nhìn thấy được). Đồng thời, chúng có tính chọn lọc cao đối với mục tiêu và năng suất lượng tử.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Kính hiển vi huỳnh quang được sử dụng rộng rãi với sự xuất hiện của thuốc nhuộm tự nhiên và tổng hợp. Họ có hồ sơ rõ ràng về cường độ phát xạ và kích thích và nhằm mục đích sinh học cụ thể.

Xác định các phân tử riêng lẻ

Thông thường, trong các điều kiện lý tưởng, có thể đăng ký sự phát sáng của một yếu tố cá nhân. Để làm điều này, trong số những thứ khác, nó là cần thiết để đảm bảo một tiếng ồn phát hiện đầy đủ thấp và một nền quang học. Các phân tử fluorescein trước khi tiêu hủy do photobleaching có thể phát ra đến 300 nghìn photon. Ở 20% số bộ sưu tập và hiệu quả của quy trình, chúng có thể được đăng ký với số lượng khoảng 60 nghìn.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Kính hiển vi huỳnh quang , dựa trên photodiod tuyết hoặc phép nhân điện tử, cho phép các nhà nghiên cứu quan sát hành vi của từng phân tử trong vài giây, và trong một số trường hợp thậm chí vài phút.

Khó khăn

Vấn đề chính là sự đàn áp tiếng ồn từ nền quang học. Do thực tế là nhiều vật liệu được sử dụng trong việc thiết kế các bộ lọc và thấu kính có sự tự huỳnh quang, nỗ lực của các nhà khoa học ở giai đoạn ban đầu tập trung vào việc sản xuất các thành phần có huỳnh quang thấp. Tuy nhiên, các thí nghiệm tiếp theo dẫn đến các kết luận mới. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Đặc biệt, người ta nhận thấy rằng kính hiển vi huỳnh quang , dựa trên sự phản xạ nội bộ, đạt được một nền thấp và một luồng sáng ánh sáng cực mạnh.

Cơ chế

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Các nguyên lý của kính hiển vi huỳnh quang , dựa trên tổng số phản xạ nội bộ, bao gồm việc sử dụng một sóng phân hủy nhanh hoặc không lan truyền. Nó phát sinh trên biên giới của phương tiện truyền thông với các chỉ số khúc xạ khác nhau . Trong trường hợp này, tia sáng đi qua lăng kính. Nó có một chỉ số khúc xạ cao.

Lăng kính được gắn với dung dịch nước hoặc kính có tham số thấp. Nếu luồng ánh sáng được hướng trực tiếp vào nó ở một góc lớn hơn chiều cao, chùm tia phản chiếu hoàn toàn từ giao diện. Hiện tượng này gây ra một làn sóng không lan truyền. Nói cách khác, một trường điện từ được tạo ra mà thâm nhập vào môi trường với một chỉ số khúc xạ nhỏ hơn cho một khoảng cách nhỏ hơn 200 nanô mét.

Trong một làn sóng không phun , cường độ ánh sáng sẽ đủ để kích thích fluorophores. Tuy nhiên, do độ sâu không đáng kể, khối lượng của nó sẽ rất nhỏ. Kết quả là, một nền cấp thấp xuất hiện.

Sửa đổi

Kính hiển vi huỳnh quang, dựa trên tổng số phản xạ nội bộ, có thể được thực hiện với sự trợ giúp của ánh sáng epi. Điều này đòi hỏi ống kính với khẩu độ số tăng lên (ít nhất là 1,4, nhưng nó là mong muốn rằng nó đạt đến 1,45-1,6), cũng như lĩnh vực được chiếu sáng từng phần của thiết bị. Loại thứ hai đạt được bằng cách sử dụng một chỗ có kích thước nhỏ. Để có độ đồng nhất lớn hơn, một vòng mỏng được sử dụng, qua đó một phần của dòng chảy bị chặn. Để có được một góc tới hạn, sau đó phản xạ hoàn toàn xảy ra, cần phải có khúc xạ lớn của môi trường ngâm trong ống kính và kính che kính hiển vi.